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实验室如何检测寨卡病毒?

仪器信息网2020-09-11 09:16:07

Zika Virus

  寨卡病毒(Zika Virus)属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),呈球形,直径约为40-70nm,有包膜。基因组为单股正链RNA,长度约为10.8Kb,可分为亚洲型和非洲型两个基因型。

 

1检测对象

(一)疑似和临床诊断病例。

(二)伊蚊成蚊和幼虫。


2样本采集、保存和贝博app体育

(一)病例标本采集。

  对怀疑感染寨卡病毒的患者,推荐采集血清标本开展检测。

用无菌真空干燥管,采集患者非抗凝血5mL,及时分离血清,分装2管,保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内,标记清楚后贝博网站多少保存,其中1管用于现场实验室检测,1管用于上级疾病预防控制机构复核。

  对病例应尽可能采集双份血液标本,两份标本之间相隔14天为宜,住院病例可于入院当天和出院前1天各采集一份。

(二)蚊媒标本采集。

  疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫,分类鉴定后,填写媒介标本采集信息表,按照采集地点分装,每管10-20只。

(三)标本保存、运送。

  如标本能够在24小时内开展实验室检测,应将标本置于2-8℃保存;如能在7天内开展检测,应将样本置于-20℃保存;如需保存7天以上,应将样本置于-70℃以下。

  标本运送时采用贝博网站多少冷藏贝博app体育,避免冻融,样本贝博app体育应遵守国家关于三类病原体的相关生物安全规定。


3检测方法

  寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应,目前主要采用病毒核酸检测。

开展蚊媒寨卡病毒检测时,对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测。

  开展寨卡病毒实验室检测时,应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。

(一)临床标本检测

1.病原学检测

病原学检测主要适用于急性期血液标本,一般认为发病7天内检测阳性率高。

(1)核酸检测:采用荧光定量RT-PCR方法,是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。

(2)病毒分离:将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养,出现病变以后,用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。

2.血清学检测

(1)血清特异性IgM抗体:发病3天后可检出病毒特异性IgM抗体,但发病7天后检出率高。可采用ELISA、免疫荧光等方法检测。IgM抗体阳性,提示患者可能新近感染寨卡病毒,但寨卡病毒IgM抗体与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等黄病毒有较强的交叉反应,易于产生假阳性。

(2)中和抗体:采用空斑减少中和试验方法检测。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高,且排除登革、乙脑等其他常见黄病毒感染,可以确诊。

(二)媒介标本检测

1.标本处理

将分类后的伊蚊成蚊或幼虫,按照采集地点,每10~20只为一份进行研磨处理。

2.病毒核酸检测

用RT-PCR的方法进行寨卡病毒核酸检测

3.病毒分离

病毒核酸阳性的标本进行病毒分离。


4生物安全


  寨卡病毒在我国归属于三类病原体,应在生物安全二级实验室(BSL-2)开展实验室检测。应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求,做好生物安全防护工作。

2014年以来美洲多个国家相继发生寨卡病毒(Zika)感染病例,世界卫生组织近日警告,寨卡病毒正呈现“暴发式传播”,预计美洲地区将有至多400万人感染这种病毒。截至目前,中国大陆尚未发现病例,但疾病预防控制中心指出我国仍存在病例输入风险。


  目前关于这种病毒传播的疑问不少,比如怀孕期间感染与造成婴儿小头畸形之间的关联,但由于目前诊断方法的局限性,还很难给出一个答案来。一组研究人员正在攻关,希望能以最快的速度研发出免疫试剂,检测是否感染Zika病毒。


  来自德州大学加尔维斯顿医学分校的Nikos Vasilakis表示,“我们正尽全力尽快给临床医师们一些答案。”


  目前,检测寨卡病毒的标准检测方法是对样本进行PCR,分析样本中的病毒RNA探针是否存在,虽然这种方法能很好的检测到病毒,但是病原体的RNA很快就会被降解掉。“在患者把样品送入临床时,病毒也许已经消失,或者只能抓住它的尾巴了,这超过了检测时间限制,”Vasilakis说。

  临床医师和流行病学家希望能在出生前几个月里就确定婴儿是否感染了寨卡病毒,为此美国疾病控制与预防中心CDC的科学家们进行了一种称为蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test) 的检测,这种方法是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法,能检测之前的感染。


  从原理上说,这一检测方法以使蚀斑数减少50%的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作, 接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37度二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。


  患者的血清中混有病毒,几天时间里研究人员观察病毒是否会感染培养基,如果没有,那么病毒就已经被血清中的抗体中和了,这表明患者曾经接触过寨卡病毒。


  CDC甲类病毒实验室主任Ann Powers表示,使用这种方法的问题在于“你必须有活体病毒,和合适安全的环境,”这意味着只有少数几个实验室能进行这种试验。


  其它更加方便的血清学测试也能检测特定病原体中的抗体,但是对于寨卡病毒来说,很难判断患者携带的黄病毒是登革热病毒,寨卡病毒还是其它病毒。“而且寨卡病毒出去的区域也正是登革热出现的地区,”来自华盛顿大学圣路易斯分校的免疫学家Mike Diamond说。


  Vasilakis 正在尝试ELISA方法,也就是检测体液中微量物质的固相免疫测定的方法,这种方法利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定,可以在感染后几个星期内检测到Zika病毒。虽然这也有可能会与其它感染发生一定程度的交叉反应,但如果Zika病毒特异性抗体浓度高就能指示出近期发生的Zika病毒感染,Vasilakis说。


  Vasilakis预计在未来几周内,Diamond研究组就会有结果,研发出一种针对Zika病毒的单克隆抗体检测方法,这能与ELISA方法结合,检测发生过的感染,“我们很早就开展了这项研究,这个月就能得到结果,”Diamond说,“初步结果表明我们的一些抗体能特异性识别Zika病毒。”


  不过即使Diamond研究组的抗体能特异性检测Zika病毒,他们也需要一些时间来建立诊断方法,“这可能还需要几个月的时间。”


  与此同时,一些生物公司也开始销售Zika血清学检测,比如MyBioSource 公司已经有售一种针对Zika的IgM ELISA检测,来自加拿大的Biocan 公司也在出售一种检测IgM和IgG抗体(后者比前者在感染后提升水平更高)的扎手指检测方法,能在5到10分钟得到结果。

  Diamond表示他们还未接触任何商业产品,Biocan目前还未给出有效数据,但是其销售部总经理Bhavjit Jauhar表示他们已经将实验室和现场检测结果呈递给巴西监管当局,“我们过去几年间一直致力于Zika病毒的研究,因为我们认为这种疫情会暴发。”

本文来源:综合现代检验医学杂志&国际检验医学杂志,侵删


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