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贝博app体育小鼠冷冻精子的新介质

中国实验动物信息网2020-05-17 08:08:28

贝博app体育小鼠遗传物质较活体贝博app体育有伦理优势且更加便利,保障动物福利的同时也避免活体动物贝博app体育相关的复杂的法规。目前贝博app体育小鼠遗传物质多选择在-196℃液氮中。由于冷冻保存和复苏技术的创新,精子冷冻正在成为一种更为方便的选择。此外,冷冻的精子对冷冻后温度的波动也较不敏感。

这篇文章证明冷冻精子可以安全的在干冰(-79℃)中储存至少七天,实验已经得到多个实验室的验证。另外,精子在干冰贝博app体育后可以返回液氮中长期储存,没有明显的影响。

实验1:六个品系小鼠精子的短暂储存(-80℃ 7天)

C57BL/6J,C57BL/6N,FVB/NJ,BALB/c,129/SvJ和CD1的野生型精子在-80℃下储存7天后IVF结果如图1A,结果显示,对比在液氮中保存的精子(C组),不论使用哪种冷冻方法(CPM,gCPA或CPA),精子可以在-80℃下储存至少7天(A组),而不会显著丧失受精能力。

图1

此外,结果表明,在-80℃储存至少7天的精子可以返回到液氮中储存(B组),而不会显著损失受精力。统计分析表明,只有“冷冻方法”和“品系背景”对IVF有显着性影响,而保存介质、保存温度无明显影响。另一方面,已经知道受精率是取决于所使用的小鼠品系的遗传背景。例如,129/SvJ精子用CPA方法受精率最低(10%±1%介于A组和C组之间)而C57BL/6N精子(A,B和C组)不管使用哪种冷冻方法受精率总是为60%。这些结果还证实CPA法是所有测试中精子冷冻/复苏效率最低的。图1B表明-80℃和液氮存储的精子复苏IVF后胚胎移植获得的后代在数量上没有显著差异。同样的,从-80℃再返回液氮冷冻的精子与以上两组也没显著差异。所有遗传背景和冷冻法都是如此。例如,C57BL/6N用gCPA方法冷冻精子获得的胚胎在所有实验组中得到了类似的数据:C组为55.40%±1.3%,A组为54.35%±2.5%,B组为55.90%±1.8%。

胚胎移植后的生仔率范围从最小值26.96%(CPA法精子冷冻近交系129/SvJ)到最大值72.20%(gCPA法精子冷冻远交系CD1),这个结果与平时数据一致。

实验2:转基因小鼠精子的短暂储存(-80℃ 7天)

实验2与实验1操作一致,除了精子的品系来源不同。在-80℃中储存7天后IVF结果(二细胞胚胎/卵母细胞百分比)如图2所示。结果显示,不论使用哪种方法(CPM,gCPA或者CPA)冷冻转基因鼠精子都可以在-80℃储存至少7天(A组),并且对比C组,再次返回液氮冷冻(B组)没有明显损失受精潜力,我们也没有观察到样品储存与其他因素之间有任何相互作用,如冷冻方法,基因和遗传背景。

在-80℃下储存的精子不会影响胚胎的发育和产仔能力,生仔率取决于品系背景,基因和冷冻方法。对于每一次的胚胎移植,三组之间的生仔率没有明显的差异,数据见图2B。

图2

实验3:模拟贝博app体育:对比在-80℃超贝博网站多少冰箱和干冰中储存7天的精子

CPM方法冷冻的转基因小鼠(C57BL/6N和C57BL/6J背景)的精子在超贝博网站多少冰箱(-80℃)、干冰(-79℃)中储存7天,TVF结果如图3A所示。对于每个遗传背景,不同组之间没有显著差异。结果表明,冷冻精子可以在-80℃超贝博网站多少冰箱或在-79℃的干冰中储存七天,而不会显著改变受精力。所有实验组中俩个品系背景有百分之五十或者更多的胚胎移植生仔(图3B)。再次证实处理本身和品系背景的相互作用对IVF和移植生仔率没有显著影响。


图3

实验4:贝博app体育转基因精子

精子样本(含C57BL/6N 背景的3个转基因和C57BL/6J背景的3个转基因)用CPM和gCPA冷冻,使用干冰贝博app体育两根麦管,图4A中显示多个实验室研究的结果,转基因的受精率在37.2% (CPM法EM03992基因)到79.4%(CPM法EM02571基因 )之间,每一个实验室都从IVF中获得二细胞胚胎。这些胚胎移植进雌鼠体内后,雌鼠有很高的生仔率,如图4B所示。实验证明了不论冷冻方法和品系背景,各实验室之间差异都很小,精子可以在干冰中贝博app体育至少三天而不丧失受精能力。

图4



本文来源:南京大学-南京生物医药研究院